16个Small RNA样本也能发5.9分文章

文章导读        

高分文章的光环不仅仅在于本身的闪光，更在于文章背后实验工作基础的扎实和结果的可靠。本期华大测序文献解读，来自华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室近期发表的Small RNA研究文章——雄性不育棉花在高温胁迫下参与生长素代谢调控的miRNA研究，该文发表在《The Plant Journal》杂志上（影响因子：5.9）。科技君在这里将给大家详细呈现：这篇仅用16个样本的Small RNA高通量测序研究, 如何成就高分文章的全要点。

长期高温（HT）胁迫导致棉花的雄性不育，最终导致作物减产。为探究HT胁迫下miRNA表达在棉花雄性不育中的分子作用机理，该研究在常温（NT）和高温（HT）条件下，对HT不敏感（84021）和HT敏感（H05）棉花品种的花药进行小RNA及降解组测序，该研究结果揭示了miR160、miRNA156等参与调控的植物激素代谢通路，对棉花在高温胁迫下花粉生殖发育有重要作用，此项研究将为未来作物提高作物产量及推广温敏核不育在杂交育种的应用有重要意义。

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前期研究基础扎实

1、 已完成了1个高温敏感（84021）和1个高温不敏感（H05）两种雄性不育系的基因表达水平研究，发现生长素代谢通路（Auxin Signaling Pathways）是花粉发育对高温胁迫应答的重要代谢通路；

2、 已根据棉花花芽发育统计，将棉花发育阶段分成细致的14个阶段。

以上步骤对目的研究样本的选择有重要指导作用。

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样本设计精细

根据前期生物学性状研究统计结果挑选:

1、 调查温度和花药长度关系，采用游标卡尺测量；

2、 在高温处理7天左右,不育性状的花芽长度一般是是6-14nm, 结合细致的发育阶段分类结果，因此挑选TS：四分体时期(6-7nm)；TDS：绒毡层退化阶段(9-14nm) 两个发育阶段；采用与转录表达研究选取相同时期样本;

3、 每个发育阶段设置2个生物学重复。

Small RNA测序样本选择

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信息分析思路清晰

精华点：采取逐级缩小miRNA研究范围,并针对高表达以及差异表达显著的miRNA研究其靶基因参与的代谢通路,进一步证实miRNA参与调控的主要功能, 解释生物学现象。

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验证方法多样

1、定量及靶向位点验证

使用qPCR方法验证miRNA和靶基因的定量，降解组高通量测序方法验证降解靶基因以及5’-RLM-RACE验证靶基因降解位点，与高通量测序结果一致。

2、功能验证

使用过表达miR160株系，结果观察到：过表达增强雄性不育系品种对高温的敏感，不育性状类似花药不开裂的状态，与ARF10 和ARF17表达受到抑制有关，从而激活植物生长素代谢通路，导致花药不开裂。当加入外源生长素-吲哚乙酸导致在84021和H05在高温状态下也同样产生明显的雄性不育表型，进一步证明miR160的重要作用。

使用过表达的miR157抑制植物生长素代谢通路，在高温胁迫后，同样出现小孢子败育和花粉不开裂表型，使得雄性不育系品对高温更加敏感。

这篇高分文章带来的重要启示：

1 在做miRNA研究的前期或者同时进行基因表达的研究；

2 在选取样本的前，需要做好生理生化指标及表型检测，筛选表型差异大的样本，这点非常重要，关乎在后续分析结果中是否能找到目的miRNA；

3 在分析过程中, 虽然有在庞大的数据分析结果,但可通过缩小目的研究范围:如表达量范围、差异倍数等等，集中精华结果以便深入研究；

4 在后期验证中，不仅选取常见的qPCR方法验证，更可以选取过表达或者缺失表达等情况进行正向或者反向验证，或者增加代谢通路中常见的外源刺激物验证表型表达，进一步证明实验结论可靠；

5 除此之外，更重要的一点是，Small RNA研究需要选择一个靠谱的高通量测序合作伙伴。

华大科技最早对Small RNA高通量测序技术进行研发，已完成多类物种的高通量测序实验，经验丰富，尤其是对微量样本的实验成功率高，对于珍稀样本的研究的确是一个福音。近期华大Small RNA产品信息分析再次升级，miRNA的定量更加精确。

★华大科技Small RNA产品优势

参考文献

[1] Ding Y, Ma Y, Liu N, et al. microRNAs involved in auxin signalling modulate male sterility under high temperature stress in cotton (Gossypium hirsutum). Plant J. 2017 Jun 21. doi: 10.1111/tpj.13620.

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撰稿：姜    莹

编辑：市场部

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